أورثو-نيتروفينيل-β-غالاكتوزيد (Ortho-Nitrophenyl-β-galactoside – ONPG)

مقدمة

أورثو-نيتروفينيل-β-غالاكتوزيد (ONPG) هو مركب كيميائي يستخدم على نطاق واسع في الكيمياء الحيوية وعلم الأحياء الجزيئي كمادة اصطناعية لدراسة نشاط إنزيم β-غالاكتوزيداز. يتميز ONPG بقدرته على إنتاج ناتج ملون عند تحلله بواسطة هذا الإنزيم، مما يجعله أداة قيمة في المقايسات اللونية والتحاليل الطيفية.

التركيب الكيميائي والخصائص

ONPG هو جزيء يتكون من جزيء الغالاكتوز مرتبط بمجموعة أورثو-نيتروفينيل. هذه المجموعة هي التي تمنح المركب القدرة على امتصاص الضوء في الطيف المرئي بعد التحلل. الصيغة الكيميائية لـ ONPG هي C₁₂H₁₅NO₈، ووزنه الجزيئي 301.25 جم/مول. يظهر ONPG عادةً كمادة صلبة بيضاء أو صفراء باهتة وهو قابل للذوبان في الماء والمذيبات القطبية الأخرى.

آلية العمل

يعمل ONPG كمادة اصطناعية لإنزيم β-غالاكتوزيداز. عندما يتم تحضين ONPG مع إنزيم β-غالاكتوزيداز، يقوم الإنزيم بتحليل الرابطة β-غالاكتوزيدية، مما يؤدي إلى إطلاق جزيء الغالاكتوز وأورثو-نيتروفينول. يعتبر أورثو-نيتروفينول الناتج كروموفور، أي أنه يمتص الضوء في منطقة معينة من الطيف المرئي. اعتمادًا على الرقم الهيدروجيني (pH) للمحلول، يظهر أورثو-نيتروفينول بلون أصفر، ويمكن قياس كميته باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند طول موجي يبلغ 420 نانومتر.

تطبيقات في الكيمياء الحيوية وعلم الأحياء الجزيئي

يستخدم ONPG على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من التطبيقات البحثية والتجارية، بما في ذلك:

قياس نشاط β-غالاكتوزيداز: يستخدم ONPG على نطاق واسع لقياس نشاط إنزيم β-غالاكتوزيداز في مستخلصات الخلايا أو المحاليل الإنزيمية النقية. تعتمد هذه الطريقة على قياس معدل إنتاج أورثو-نيتروفينول بمرور الوقت، والذي يتناسب طرديًا مع نشاط الإنزيم.
فحص الطفرات في جين اللاك أوبرون: في علم الأحياء الدقيقة، يستخدم ONPG لفحص الطفرات في جين اللاك أوبرون (lac operon) في بكتيريا الإشريكية القولونية (Escherichia coli). اللاك أوبرون هو مجموعة من الجينات التي تتحكم في استقلاب اللاكتوز. يمكن للبكتيريا التي تحمل نسخة وظيفية من جين اللاك أوبرون أن تحلل اللاكتوز وتنتج إنزيم β-غالاكتوزيداز، مما يؤدي إلى تحويل ONPG عديم اللون إلى أورثو-نيتروفينول الأصفر.
مقايسة الإنزيم المرتبط بالمناعة (ELISA): يمكن استخدام ONPG كمادة في بعض أنواع مقايسة الإنزيم المرتبط بالمناعة (ELISA). في هذه المقايسات، يتم استخدام إنزيم β-غالاكتوزيداز كعلامة للكشف عن وجود مستضد أو جسم مضاد معين.
مقايسة البروتينات المؤتلفة: يستخدم ONPG في مقايسة البروتينات المؤتلفة التي تعتمد على استخدام علامة β-غالاكتوزيداز. يتم دمج الجين الخاص بالبروتين المؤتلف مع جين β-غالاكتوزيداز، ويتم التعبير عن البروتين المدمج في الخلايا المضيفة. يمكن بعد ذلك استخدام ONPG للكشف عن وجود البروتين المؤتلف عن طريق قياس نشاط β-غالاكتوزيداز.
دراسة تنظيم الجينات: يستخدم ONPG في دراسة تنظيم الجينات عن طريق قياس نشاط المحفزات المختلفة. يتم دمج المحفز المراد دراسته مع جين β-غالاكتوزيداز، ويتم إدخال البناء في الخلايا المضيفة. يمكن بعد ذلك استخدام ONPG لقياس مستوى التعبير عن جين β-غالاكتوزيداز، والذي يعكس نشاط المحفز.

بروتوكولات استخدام ONPG

يتضمن استخدام ONPG عادةً الخطوات التالية:

تحضير محلول ONPG: يتم تحضير محلول ONPG عادةً بتركيز يتراوح بين 1-4 مجم/مل في محلول منظم مناسب، مثل محلول فوسفات الصوديوم. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني (pH) للمحلول بين 7.0 و 7.5 للحصول على أفضل النتائج.
تحضين الإنزيم مع ONPG: يتم تحضين الإنزيم β-غالاكتوزيداز مع محلول ONPG في درجة حرارة مناسبة (عادةً 37 درجة مئوية) لفترة زمنية محددة.
إيقاف التفاعل: يتم إيقاف التفاعل عن طريق إضافة محلول قاعدي، مثل كربونات الصوديوم، لرفع الرقم الهيدروجيني (pH) إلى حوالي 11.0. هذا يؤدي إلى زيادة امتصاص أورثو-نيتروفينول للضوء عند 420 نانومتر.
قياس الامتصاص: يتم قياس الامتصاص للمحلول الناتج باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند طول موجي يبلغ 420 نانومتر. يتم استخدام قيمة الامتصاص لحساب نشاط الإنزيم.

اعتبارات السلامة

ONPG يعتبر بشكل عام مادة كيميائية آمنة عند التعامل معها بشكل صحيح. ومع ذلك، يجب اتخاذ الاحتياطات التالية عند استخدامه:

ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، مثل القفازات والنظارات الواقية، لمنع ملامسة الجلد والعينين.
التعامل مع ONPG في منطقة جيدة التهوية لتجنب استنشاق الغبار.
التخلص من النفايات الكيميائية بشكل صحيح وفقًا للوائح المحلية.

العوامل المؤثرة على نشاط β-غالاكتوزيداز

هناك عدة عوامل يمكن أن تؤثر على نشاط إنزيم β-غالاكتوزيداز، وبالتالي تؤثر على نتائج المقايسات التي تعتمد على ONPG. من بين هذه العوامل:

درجة الحرارة: يؤثر تغير درجة الحرارة على سرعة التفاعل الإنزيمي. عادةً ما يكون لإنزيم β-غالاكتوزيداز درجة حرارة مثالية يعمل عندها بأعلى كفاءة.
الرقم الهيدروجيني (pH): يؤثر الرقم الهيدروجيني للمحلول على نشاط الإنزيم. عادةً ما يكون لإنزيم β-غالاكتوزيداز رقم هيدروجيني مثالي يعمل عنده بأعلى كفاءة.
تركيز الإنزيم والمادة المتفاعلة: يؤثر تركيز الإنزيم وتركيز المادة المتفاعلة (ONPG) على سرعة التفاعل. كلما زاد تركيز الإنزيم أو المادة المتفاعلة، زادت سرعة التفاعل حتى الوصول إلى نقطة التشبع.
وجود مثبطات أو منشطات: يمكن أن يؤثر وجود مثبطات أو منشطات للإنزيم على نشاطه. يمكن للمثبطات أن تقلل من نشاط الإنزيم، بينما يمكن للمنشطات أن تزيده.
قوة الأيونات: يمكن أن تؤثر قوة الأيونات للمحلول على نشاط الإنزيم.

مزايا وعيوب استخدام ONPG

مزايا:

حساسية عالية: يمكن استخدام ONPG للكشف عن كميات صغيرة جدًا من إنزيم β-غالاكتوزيداز.
سهولة الاستخدام: تعتبر المقايسات التي تعتمد على ONPG سهلة التنفيذ نسبيًا ولا تتطلب معدات معقدة.
غير مكلف: ONPG مادة كيميائية غير مكلفة نسبيًا.

عيوب:

يتأثر بالرقم الهيدروجيني: يعتمد لون أورثو-نيتروفينول على الرقم الهيدروجيني للمحلول، مما قد يؤثر على دقة القياسات.
قد يكون سامًا للخلايا: قد يكون ONPG سامًا للخلايا بتركيزات عالية، مما قد يحد من استخدامه في بعض التطبيقات.

بدائل ONPG

على الرغم من أن ONPG يستخدم على نطاق واسع، إلا أن هناك بدائل أخرى يمكن استخدامها لقياس نشاط إنزيم β-غالاكتوزيداز. بعض البدائل الشائعة تشمل:

فلوروجينيك سوبستريتس (Fluorogenic Substrates): هذه المواد تعطي إشارة فلورية عند تحللها بواسطة إنزيم β-غالاكتوزيداز. عادةً ما تكون هذه المواد أكثر حساسية من ONPG، ولكنها تتطلب استخدام مقياس الفلورية لقياس الإشارة.
كروموجينيك سوبستريتس (Chromogenic Substrates): هذه المواد تعطي لونًا مختلفًا عند تحللها بواسطة إنزيم β-غالاكتوزيداز. يمكن استخدام هذه المواد في المقايسات اللونية المشابهة لتلك التي تستخدم ONPG.

خاتمة

يظل أورثو-نيتروفينيل-β-غالاكتوزيد (ONPG) أداة حيوية في الكيمياء الحيوية وعلم الأحياء الجزيئي، وذلك بفضل سهولة استخدامه وحساسيته العالية في الكشف عن نشاط إنزيم β-غالاكتوزيداز. على الرغم من وجود بدائل أخرى، إلا أن ONPG يظل خيارًا شائعًا وموثوقًا للعديد من التطبيقات البحثية والتجارية.