اختبار البيوريت (Biuret Test)

مقدمة

اختبار البيوريت (Biuret test)، المعروف أيضًا باسم اختبار بيوتروفسكي، هو اختبار كيميائي يُستخدم للكشف عن وجود الببتيدات والبروتينات في العينة. يعتمد هذا الاختبار على تفاعل أيونات النحاس الثنائي (Cu²⁺) في محلول قلوي مع الروابط الببتيدية الموجودة في البروتينات أو الببتيدات، مما يؤدي إلى تكوين مركب بنفسجي اللون. شدة اللون تتناسب طرديًا مع تركيز البروتينات أو الببتيدات الموجودة في العينة، مما يسمح بتقدير كمية البروتين الموجودة.

مبدأ عمل اختبار البيوريت

يعتمد اختبار البيوريت على وجود الروابط الببتيدية (-CO-NH-) التي تربط الأحماض الأمينية معًا في البروتينات والببتيدات. في المحلول القلوي، تتفاعل أيونات النحاس الثنائي مع ذرات النيتروجين الموجودة في الروابط الببتيدية، مما يؤدي إلى تكوين معقد تنسيقي بنفسجي اللون. هذا المعقد التنسيقي يتكون من أربعة ذرات نيتروجين مرتبطة بأيون النحاس الثنائي.

البيوريت نفسه (H₂N-CO-NH-CO-NH₂) هو مركب عضوي يتكون من جزيئين من اليوريا مرتبطين معًا. على الرغم من أن الاختبار يحمل اسم البيوريت، إلا أن المركب نفسه ليس ضروريًا لحدوث التفاعل. ببساطة، أي مادة تحتوي على رابطتين ببتيديتين على الأقل قادرة على إعطاء نتيجة إيجابية لاختبار البيوريت.

المواد والكواشف المستخدمة في اختبار البيوريت

لإجراء اختبار البيوريت، تحتاج إلى المواد والكواشف التالية:

محلول البيوريت: يتكون عادة من كبريتات النحاس الثنائي (CuSO₄) وهيدروكسيد الصوديوم (NaOH) أو هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH).
محلول قياسي للبروتين: يستخدم للمعايرة وإنشاء منحنى قياسي.
عينة الاختبار: تحتوي على البروتين أو الببتيد المراد الكشف عنه.
أنابيب اختبار نظيفة وجافة.
ماصة (Pipette) لنقل المحاليل بدقة.
جهاز قياس الطيف الضوئي (Spectrophotometer) (اختياري): لقياس امتصاص اللون البنفسجي بشكل كمي.

طريقة إجراء اختبار البيوريت

فيما يلي خطوات إجراء اختبار البيوريت:

تحضير العينات: قم بتحضير العينات المراد اختبارها عن طريق إذابة المادة في الماء أو محلول ملحي مناسب.
إضافة محلول البيوريت: أضف حجمًا محددًا من محلول البيوريت إلى كل أنبوب اختبار يحتوي على العينة. عادةً ما تكون نسبة محلول البيوريت إلى العينة 1:1 أو 1:2.
الخلط والانتظار: امزج المحتويات جيدًا واتركها لتتفاعل لمدة 30 دقيقة على الأقل.
الملاحظة: لاحظ التغير في اللون. يشير ظهور اللون البنفسجي إلى وجود البروتينات أو الببتيدات.
القياس الكمي (اختياري): إذا كنت ترغب في تحديد تركيز البروتين بدقة، استخدم جهاز قياس الطيف الضوئي لقياس امتصاص اللون البنفسجي عند طول موجي محدد (عادة حوالي 540 نانومتر).
إنشاء المنحنى القياسي (اختياري): قم بإنشاء منحنى قياسي باستخدام محاليل قياسية للبروتين بتركيزات معروفة. قارن امتصاص العينات المجهولة بالمنحنى القياسي لتحديد تركيز البروتين.

العوامل المؤثرة على نتائج اختبار البيوريت

هناك عدة عوامل يمكن أن تؤثر على نتائج اختبار البيوريت، وتشمل:

التركيز: كلما زاد تركيز البروتين أو الببتيد في العينة، زادت شدة اللون البنفسجي.
الرقم الهيدروجيني (pH): يجب أن يكون المحلول قلويًا لحدوث التفاعل.
درجة الحرارة: يمكن أن تؤثر درجة الحرارة على سرعة التفاعل وتشكيل اللون.
وجود مواد متداخلة: بعض المواد مثل الأملاح والأحماض الأمينية الحرة يمكن أن تتداخل مع التفاعل وتؤثر على النتائج.
وقت التفاعل: يجب أن يكون هناك وقت كافٍ للتفاعل بين أيونات النحاس والروابط الببتيدية لتكوين اللون البنفسجي الكامل.

تطبيقات اختبار البيوريت

يستخدم اختبار البيوريت في العديد من التطبيقات المختلفة، بما في ذلك:

تقدير البروتين في البحوث البيوكيميائية: يستخدم لتحديد تركيز البروتين في المحاليل البيولوجية المختلفة، مثل مصل الدم والبول والسائل النخاعي.
مراقبة جودة الأغذية: يستخدم لتقدير محتوى البروتين في الأطعمة المختلفة.
تحليل البروتين في الصناعات الدوائية: يستخدم لتقدير تركيز البروتينات في المنتجات الدوائية.
الكشف عن تزوير الحليب: يستخدم للكشف عن إضافة الماء أو مواد أخرى لتقليل محتوى البروتين في الحليب.
التعليم: يستخدم في المختبرات التعليمية لتعليم الطلاب مبادئ الكيمياء الحيوية وتقنيات تقدير البروتين.

مزايا وعيوب اختبار البيوريت

مزايا اختبار البيوريت:

بسيط وسهل الإجراء: لا يتطلب الاختبار معدات معقدة أو مهارات متخصصة.
رخيص: الكواشف المستخدمة في الاختبار رخيصة ومتوفرة بسهولة.
مطبق على نطاق واسع: يمكن استخدامه لتقدير البروتين في مجموعة واسعة من العينات.

عيوب اختبار البيوريت:

غير حساس: أقل حساسية من بعض الطرق الأخرى لتقدير البروتين، مثل اختبار برادفورد أو اختبار حمض اللوريك.
يتأثر بالمواد المتداخلة: يمكن أن تتداخل بعض المواد مع التفاعل وتؤثر على النتائج.
غير دقيق للغاية: قد لا يكون دقيقًا للغاية في تقدير تركيزات البروتين المنخفضة.

بدائل اختبار البيوريت

هناك عدة بدائل لاختبار البيوريت تستخدم لتقدير البروتين، ولكل منها مزاياها وعيوبها الخاصة:

اختبار برادفورد: يعتمد على ارتباط صبغة كوميسي الزرقاء جي-250 بالبروتينات، مما يؤدي إلى تغيير في لون الصبغة يمكن قياسه باستخدام جهاز قياس الطيف الضوئي. يعتبر اختبار برادفورد أكثر حساسية من اختبار البيوريت وأقل تأثرًا بالمواد المتداخلة.
اختبار حمض اللوريك: يعتمد على تفاعل البروتينات مع حمض اللوريك وفولين-سيوكالتيو، مما يؤدي إلى تكوين لون أزرق يمكن قياسه باستخدام جهاز قياس الطيف الضوئي. يعتبر اختبار حمض اللوريك حساسًا جدًا ويمكن استخدامه لتقدير تركيزات البروتين المنخفضة.
قياس الامتصاص عند 280 نانومتر: تعتمد هذه الطريقة على قياس امتصاص البروتينات للأشعة فوق البنفسجية عند طول موجي 280 نانومتر. الأحماض الأمينية العطرية، مثل التيروسين والتربتوفان، هي المسؤولة عن هذا الامتصاص. تعتبر هذه الطريقة سريعة وسهلة، ولكنها قد تكون غير دقيقة إذا كانت العينة تحتوي على مواد أخرى تمتص الأشعة فوق البنفسجية.

خاتمة

اختبار البيوريت هو اختبار كيميائي بسيط ومفيد للكشف عن وجود البروتينات والببتيدات في العينات المختلفة. على الرغم من أنه ليس الاختبار الأكثر حساسية أو دقة، إلا أنه لا يزال يستخدم على نطاق واسع في العديد من التطبيقات بسبب بساطته ورخصه وسهولة إجرائه. يجب أن يكون المستخدمون على دراية بالعوامل التي يمكن أن تؤثر على نتائج الاختبار واختيار الطريقة الأنسب لتقدير البروتين بناءً على احتياجاتهم.