مقدمة
مقايسة لوري للبروتين هي اختبار كيميائي حيوي يستخدم لتحديد تركيز البروتين الكلي في محلول. تعتمد هذه الطريقة على تفاعل البروتينات مع كاشف فولين-سيوكالتو (Folin-Ciocalteu reagent) في وجود أيونات النحاس، مما يؤدي إلى تكوين لون أزرق يمكن قياسه ضوئيًا. تعتبر مقايسة لوري من الطرق الكلاسيكية والمستخدمة على نطاق واسع في الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية لتقدير كمية البروتين في العينات المختلفة.
مبدأ عمل مقايسة لوري
تعتمد مقايسة لوري على خطوتين رئيسيتين:
- تفاعل أيونات النحاس مع البروتينات: في البداية، تتفاعل البروتينات مع أيونات النحاس في محلول قلوي. ترتبط أيونات النحاس ببقايا التيروسين والتريبتوفان والسيستين في البروتين، مما يؤدي إلى اختزال أيونات النحاس.
- اختزال كاشف فولين-سيوكالتو: بعد ذلك، يتم إضافة كاشف فولين-سيوكالتو، وهو عبارة عن خليط من حمض الفوسفوموليبيك وحمض الفوسفوتنجستيك. تختزل أيونات النحاس المختزلة كاشف فولين-سيوكالتو، مما يؤدي إلى تكوين لون أزرق. شدة اللون الأزرق تتناسب طرديًا مع تركيز البروتين في العينة.
يمكن قياس شدة اللون الأزرق باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند طول موجي معين، عادةً 750 نانومتر. من خلال مقارنة القراءة الضوئية للعينة مع القراءات الضوئية لسلسلة من المحاليل القياسية ذات التركيزات المعروفة من البروتين، يمكن تحديد تركيز البروتين في العينة المجهولة.
خطوات إجراء مقايسة لوري
تتضمن مقايسة لوري عدة خطوات أساسية يجب اتباعها للحصول على نتائج دقيقة وموثوقة:
- تحضير المحاليل:
- المحلول القياسي للبروتين: يتم تحضير سلسلة من المحاليل القياسية بتركيزات معروفة من البروتين، مثل بروتين مصل الألبومين البقري (BSA).
- الكاشف A: يتكون عادةً من كربونات الصوديوم في هيدروكسيد الصوديوم.
- الكاشف B: يتكون عادةً من كبريتات النحاس.
- الكاشف C: يتكون عادةً من تارتارات الصوديوم أو البوتاسيوم.
- كاشف لوري: يتم تحضيره عن طريق خلط الكواشف A و B و C بنسب محددة.
- كاشف فولين-سيوكالتو المخفف: يتم تخفيف كاشف فولين-سيوكالتو بالماء المقطر بنسبة محددة.
- تحضير العينات: يتم تحضير العينات المراد قياس تركيز البروتين فيها عن طريق تخفيفها بالماء المقطر أو بالمحلول المناسب.
- إجراء المقايسة:
- يتم إضافة حجم معين من العينة أو المحلول القياسي إلى أنبوب اختبار.
- يضاف حجم معين من كاشف لوري إلى الأنبوب ويخلط جيدًا.
- يترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-20 دقيقة.
- يضاف حجم معين من كاشف فولين-سيوكالتو المخفف إلى الأنبوب ويخلط جيدًا.
- يترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- قياس الامتصاص: يتم قياس الامتصاص الضوئي للمحلول الناتج باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند طول موجي 750 نانومتر.
- رسم المنحنى القياسي: يتم رسم منحنى قياسي عن طريق رسم الامتصاص الضوئي للمحاليل القياسية مقابل تركيز البروتين المعروف.
- تحديد تركيز البروتين في العينة: يتم تحديد تركيز البروتين في العينة المجهولة عن طريق مقارنة الامتصاص الضوئي للعينة مع المنحنى القياسي.
العوامل المؤثرة على مقايسة لوري
توجد عدة عوامل يمكن أن تؤثر على دقة وموثوقية مقايسة لوري، ومن أهم هذه العوامل:
- التداخلات الكيميائية: بعض المواد الكيميائية يمكن أن تتداخل مع تفاعل لوري وتؤثر على النتائج. على سبيل المثال، يمكن أن تتداخل المواد المختزلة والمواد المؤكسدة مع التفاعل وتؤدي إلى نتائج غير دقيقة.
- التركيب الحمضي الأميني للبروتين: تختلف استجابة البروتينات المختلفة لمقايسة لوري اعتمادًا على تركيبها الحمضي الأميني. البروتينات التي تحتوي على نسبة عالية من التيروسين والتريبتوفان والسيستين تعطي قراءات أعلى من البروتينات التي تحتوي على نسبة منخفضة من هذه الأحماض الأمينية.
- درجة الحموضة: يجب أن تكون درجة الحموضة للمحلول ضمن النطاق الأمثل لحدوث التفاعل. قد تؤدي التغيرات في درجة الحموضة إلى نتائج غير دقيقة.
- درجة الحرارة: يجب الحفاظ على درجة حرارة ثابتة أثناء إجراء المقايسة لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار.
- وقت الحضانة: يجب الالتزام بوقت الحضانة المحدد في البروتوكول لضمان اكتمال التفاعل.
مزايا وعيوب مقايسة لوري
المزايا:
- الحساسية العالية: تتميز مقايسة لوري بحساسيتها العالية، مما يجعلها مناسبة لتقدير كميات صغيرة من البروتين.
- التوفر: الكواشف المستخدمة في مقايسة لوري متوفرة بسهولة ورخيصة الثمن.
- البساطة: تعتبر مقايسة لوري طريقة بسيطة وسهلة التنفيذ.
العيوب:
- التداخلات: تتأثر مقايسة لوري بالعديد من المواد الكيميائية، مما قد يؤدي إلى نتائج غير دقيقة.
- الاعتماد على نوع البروتين: تختلف استجابة البروتينات المختلفة لمقايسة لوري اعتمادًا على تركيبها الحمضي الأميني.
- غير مناسبة للعينات المعقدة: قد تكون مقايسة لوري غير مناسبة لتقدير البروتين في العينات المعقدة التي تحتوي على العديد من المواد المتداخلة.
بدائل لمقايسة لوري
توجد العديد من الطرق البديلة لتقدير تركيز البروتين، ومن أهمها:
- مقايسة برادفورد (Bradford Assay): تعتمد على ارتباط صبغة كومآسي الزرقاء اللامعة (Coomassie Brilliant Blue G-250) بالبروتينات، مما يؤدي إلى تغيير لون الصبغة. تعتبر مقايسة برادفورد أسرع وأقل عرضة للتداخلات من مقايسة لوري.
- مقايسة بيكينش (Bicinchoninic Acid Assay – BCA): تعتمد على تفاعل البروتينات مع حمض البيكينشونين (BCA) في وجود أيونات النحاس، مما يؤدي إلى تكوين لون بنفسجي يمكن قياسه ضوئيًا. تعتبر مقايسة BCA أكثر حساسية من مقايسة لوري وأقل عرضة للتداخلات.
- قياس الامتصاص الضوئي المباشر عند 280 نانومتر: تعتمد على قياس الامتصاص الضوئي للبروتينات عند طول موجي 280 نانومتر، حيث تمتص الأحماض الأمينية العطرية (التيروسين والتريبتوفان والفينيل ألانين) الضوء في هذا الطول الموجي. هذه الطريقة سريعة وسهلة، ولكنها أقل حساسية من الطرق الأخرى.
تطبيقات مقايسة لوري
تستخدم مقايسة لوري على نطاق واسع في العديد من التطبيقات البحثية والتطبيقية، ومن أهم هذه التطبيقات:
- تقدير تركيز البروتين في المستخلصات الخلوية والأنسجة.
- مراقبة عملية تنقية البروتينات.
- تحديد تركيز البروتين في الأغذية والأعلاف.
- قياس نشاط الإنزيمات.
- تحديد كمية البروتين المرتبط بالخلايا أو الأسطح.
خاتمة
تعتبر مقايسة لوري للبروتين طريقة كلاسيكية ومستخدمة على نطاق واسع لتقدير تركيز البروتين الكلي في المحاليل. على الرغم من وجود طرق بديلة أكثر حداثة، إلا أن مقايسة لوري لا تزال تحظى بشعبية كبيرة بسبب بساطتها وتوفرها وحساسيتها العالية. يجب على الباحثين أن يكونوا على دراية بالعوامل التي يمكن أن تؤثر على دقة المقايسة وأن يختاروا الطريقة الأنسب لتقدير البروتين بناءً على طبيعة العينة والتطبيق المطلوب.